Halo 3 se centra en la guerra interestelar entre la humanidad del siglo 26 y una agrupación de razas alienígenas conocida como el Covenant, la cual, después de una larga guerra de décadas, ha comenzado una invasión a la Tierra. El jugador asume el papel del Jefe maestro (Master Chief), un supersoldado genéticamente mejorado, que participa en la defensa de la Tierra.

Tomando lugar brevemente después de la serie de historietas Halo:Uprising, Halo 3 comienza con el Jefe Maestro cayendo a la atmósfera terrestre e impactando en una jungla africana, donde es recogido por el Inquisidor y el Sargento Johnson. El Jefe Maestro y compañía se abren paso hacia una base del UNCS, donde Miranda Keyes y Lord Hood planean un ataque aéreo hacia las naves del Profeta de la verdad, que se han estacionado sobre un misterioso artefacto Forerunner, el "Arca". Cuando el Jefe destruye todas las fuerzas antiaéreas del Covenant en la ciudad de Voi, Hood comienza su ataque, sin embargo Verdad activa el artefacto antes de lo esperado, que se revela como un portal por el que el y sus seguidores pasan. Luego, una nave Covenant en control de los Flood  llega a la Tierra y se estrella en Voi, infectándola. desenterrado de las arenas de las ruinas de la ciudad de Nueva Bombasa

Las fuerzas Elites también arriban y detienen la amenaza parasita disparando hacia las zonas consumidas, pero al costo de perder la ciudad. En la nave nodriza Elite, la "Sombra de Intención", ahora capitaneada por Rtas Vadum, el Jefe y el resto ven un mensaje dejado por Cortana a bordo de la nave infectada, quien dice que a través del portal hay una solución para los Flood. El Jefe y los demás deciden pasar por el, a excepción de Hood, quien decide quedarse en la Tierra para proteger lo que queda. Uniéndoseles en su viaje es 343 Guilty Spark, quien al igual que los Elites ha conformado una alianza con los Humanos.

Al traspasar el portal el Jefe maestro y compañía descubren la verdadera Arca, una instalación masiva al borde de la Vía Láctea. Al llegar a ella, el Jefe y Guilty Spark localizan el mapa Cartógrafo de la Instalación que les da la localización exacta de Verdad. Al desactivar la última barrera energética defensiva del Centro de Control del Arca, Suma caridad, la formal ciudadela Coveant ahora tomada por los Flood llega a la Instalación y se estrella en esta, y los Flood proceden a invadirla. El Jefe y el Inquisidor se ven forzados a unirse temporalmente con Gravemind, el líder Flood, para detener a Verdad de activar la serie de anillos de Halo y comenzar lo que el llama el Gran Viajeque según el llevara a todos los del Covenant hacia la salvación y la inmortalidad. Verdad captura a Johnson, ya que solo los humanos pueden manipular tecnologíaForerunner. Keyes trata de salvarlo, pero es asesinada por el Profeta. Una vez que las fuerzas protectoras de Verdad han sido diezmadas, el Jefe detiene el disparo de los anillos y el Inquisidor mata a Verdad. Con la activación de los anillos parada, Gravemind traiciona al duo y Johnson escapa. El Jefe descubre un nuevo anillo Halo siendo construido en el Arca, un reemplazo para el que el destruyo en el primer juego. El Jefe decide encenderlo para acabar con los Flood de una vez por todas pero primero va a las ruinas de suma caridadpara rescatar a Cortana, quien ha conservado el Índice de activación de Alpha Halo. En su escape el Jefe destruye el reactor de Suma Caridad, haciéndola explotar y aparentemente matando a Gravemind en el progreso.

Al llegar a Halo Cortana descubre que Gravemind sobrevivió y que esta reconstruyéndose en el anillo. En la Sala de Control del anillo Johnson es asesinado por Spark cuando este descubre su plan de encenderlo, ya que una activación prematura destruiría el anillo y dañaría el Arca. Spark es subsecuentemente destruido por el Jefe y este enciende Halo. El Jefe, Cortana y el Inquisidor huyen hacia una fragata del UNCS, la "Forward Unto Dawn" a medida que Halo se cae a pedazos. Sin embargo, solo la mitad superior de esta, cargando al Inquisidor pasa por el portal, que colapsa.

De vuelta en la Tierra un homenaje hacia los caídos en la guerra es dirigido por Lord Hood y el Inquisidor y los Elites sobrevivientes regresan a su planeta natal. Después de los créditos se muestra al jefe maestro y Cortana, vivos y varados en la galaxia en la mitad inferior de la Dawn. Cortana envía una señal de auxilio, aunque sabe que podría tardar años en ser recibida, y el Jefe entra en una cámara criogénica para spartans, no sin antes decirle a cortana "Despiertame, cuando me necesites". Si se completa la campaña en nivel legendario en una ecena extra aparesera master chief en un planeta desconocido.